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關(guān)稅大戰(zhàn)按下暫停鍵，流式er驚魂未定，美國(guó)產(chǎn)試劑漲價(jià)預(yù)警，流式實(shí)驗(yàn)如何降本增效？
Bio X Cell（國(guó)內(nèi)一級(jí)授權(quán)代理商生物）以其高品質(zhì)的體內(nèi)功能級(jí)抗體享-譽(yù)全-球，鮮為人知的是B家還有不少在體外實(shí)驗(yàn)中應(yīng)用廣泛的隱藏好物，今天我們就來(lái)聊聊用于Fc受體阻斷的抗小鼠CD16/CD32抗體。
為什么要阻斷Fc受體
抗體的結(jié)構(gòu)是一個(gè) Y 型，由高度可變的抗原結(jié)合片段（Fab段，fragment antigen-binding）和可結(jié)晶片段（Fc段，fragment crystallizable）組成，前者負(fù)責(zé)識(shí)別和結(jié)合抗原，后者通過(guò)結(jié)合Fc受體（FcR）介導(dǎo)其他免疫途徑的效應(yīng)功能，比如抗體依賴性細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞毒性和吞噬作用，抗原提呈，以及趨化因子和細(xì)胞因子的分泌[1,2]。
而在基于抗原-抗體反應(yīng)的細(xì)胞分析比如流式實(shí)驗(yàn)中，F(xiàn)c受體與抗體Fc段的結(jié)合卻會(huì)成為干擾因素，產(chǎn)生抗原檢測(cè)的假陽(yáng)性信號(hào)。Fc受體阻斷就是在檢測(cè)抗體孵育之前先封閉掉Fc受體。
圖1 抗體結(jié)構(gòu)示意
Fc受體的表達(dá)與分類
抗體的恒定區(qū)決定了抗體的同種型，F(xiàn)c受體根據(jù)所結(jié)合的抗體同種型分類，以日常實(shí)驗(yàn)和臨床藥物研發(fā)中使用最多的IgG為例，其Fc受體稱為FcγR。人和小鼠有三個(gè)FcγR亞家族，包括高親和力、能夠結(jié)合單體IgG的FcγRI（CD64），低親和力、主要結(jié)合抗原-抗體免疫復(fù)合物（IC IgG）的FcγRII（CD32）和FcγRIII（CD16）。此外，小鼠還有獨(dú)-特的高親和力 FcγRIV（CD16.2）[2]。
大部分免疫細(xì)胞尤其是髓系細(xì)胞表達(dá)FcγR，比如在小鼠中，巨噬細(xì)胞和單核細(xì)胞高表達(dá)幾乎所有類型FcγR，樹(shù)突狀細(xì)胞也表達(dá)多種FcγR，中性粒細(xì)胞表達(dá)FcγRIV（CD16.2）和FcγRIII（CD16），B細(xì)胞主要表達(dá)FcγRII（CD32），NK細(xì)胞表達(dá)FcγRIII（CD16） [2,3]。
圖2 小鼠FcγR的表達(dá)模式及與小鼠IgG1、IgG2a/c和IgG2b的親和力[2]
什么時(shí)候要做Fc受體阻斷
研究高表達(dá)Fc受體的細(xì)胞類型，比如單核細(xì)胞和巨噬細(xì)胞，必須要做Fc受體阻斷。Andersen等人詳細(xì)測(cè)定了流式實(shí)驗(yàn)中的Fc受體結(jié)合，發(fā)現(xiàn)人外周血單個(gè)核細(xì)胞和單核來(lái)源巨噬細(xì)胞與小鼠IgG1和IgG2a有很強(qiáng)的非特異結(jié)合，而商業(yè)化Fc 阻斷劑、小鼠或人血清，或是高濃度的小鼠或人IgG都能消除這種非特異信號(hào)[4]。
如果關(guān)注的不是免疫細(xì)胞，比如腫瘤細(xì)胞，當(dāng)樣本可能富含免疫細(xì)胞，像是實(shí)體腫瘤的細(xì)胞懸液，仍然需要避免腫瘤浸潤(rùn)白細(xì)胞的影響。一般來(lái)講，實(shí)體組織來(lái)源的原代細(xì)胞在做流式實(shí)驗(yàn)時(shí)都需要進(jìn)行Fc受體阻斷。另外，對(duì)于表達(dá)水平較低的指標(biāo)，或是較為稀有的細(xì)胞，F(xiàn)c受體阻斷能夠降低噪音，提高靈敏度。
圖3 人外周血單個(gè)核細(xì)胞使用不同F(xiàn)c受體阻斷試劑時(shí)不同同型對(duì)照的中位熒光強(qiáng)度[4]
然而并非所有流式實(shí)驗(yàn)都需要進(jìn)行Fc受體阻斷。明確的不表達(dá)Fc受體的細(xì)胞系，或是高純度的不表達(dá)Fc受體的細(xì)胞，比如腫瘤細(xì)胞、上皮細(xì)胞、T細(xì)胞，沒(méi)有抗體結(jié)合Fc受體的風(fēng)險(xiǎn)。而使用Fc段突變改造消除Fc受體結(jié)合能力的重組抗體能夠從根源上避免這類假陽(yáng)性信號(hào)。
Bio X Cell隱藏好物，抗小鼠CD16/CD32抗體
大家可能從前面的參考文獻(xiàn)已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了，多種試劑都能阻斷Fc受體。其中商品化的Fc受體阻斷劑多為純化的Fc受體的抗體，比如常見(jiàn)的小鼠Fc受體阻斷劑就是小鼠CD16/CD32的抗體，比血清的批間一致性更高，比所有IgG混合物的特異性更強(qiáng)。這里我們推薦B家抗小鼠CD16/CD32抗體，助您實(shí)驗(yàn)降本增效：
信息透明：成分、克隆和濃度信息一-應(yīng)俱-全，InVivoMAb anti-mouse CD16/CD32（#BE0307）克隆2.4G2，同種型為大鼠IgG2b，與小鼠 CD16和 CD32的共有表位特異性反應(yīng)，還有報(bào)道能非特異結(jié)合 FcγRI。注意如果在免疫檢測(cè)中需要使用二抗，不能用抗大鼠 IgG2b抗體。
充分驗(yàn)證：克隆2.4G2的分離與鑒定最早發(fā)表于1979年[5]，現(xiàn)在是最-常用的小鼠Fc受體阻斷劑克隆之一。根據(jù)CiteAb網(wǎng)站統(tǒng)計(jì)，#BE0307的引用文獻(xiàn)已達(dá)280篇，覆蓋流式、免疫熒光、磁珠分選和功能實(shí)驗(yàn)等諸多應(yīng)用。
廣泛適用：#BE0307屬于InVivoMAb系列，高純度（>95%），低內(nèi)毒素（<2EU/mg），尤其適合后續(xù)功能實(shí)驗(yàn)，甚至可以用于體內(nèi)阻斷。Bio X Cell還提供內(nèi)毒素低于1EU/mg的InVivoPlus版本（#BP0307）。
文獻(xiàn)案例
Arlauckas等人[6]為了探究為何有時(shí)腫瘤不響應(yīng)PD-1單抗治療，利用體內(nèi)熒光顯微成像追蹤PD-1單抗在腫瘤微環(huán)境中的動(dòng)態(tài)，發(fā)現(xiàn)抗體藥在給藥后幾分鐘內(nèi)即有效結(jié)合瘤浸潤(rùn)的PD-1? CD8? T細(xì)胞，但是隨后從T細(xì)胞表面被腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞（TAM）“搶奪"并內(nèi)吞，限制了藥物的持續(xù)作用。隨后應(yīng)用抗小鼠CD16/CD32抗體進(jìn)行體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)，證實(shí)TAM對(duì)PD-1抗體的“搶奪"依賴于Fc-FcγR的互作。
o 體外共培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)：將熒光標(biāo)記的PD-1抗體與T細(xì)胞預(yù)孵育，再與骨髓來(lái)源巨噬細(xì)胞共培養(yǎng)，在體系中加入抗體阻斷FcγRII/III，能夠顯著減少PD-1抗體熒光從T細(xì)胞向巨噬細(xì)胞的轉(zhuǎn)移。
o 小鼠體內(nèi)實(shí)驗(yàn)：在PD-1單抗給藥前連續(xù)5天每天腹腔注射200μg小鼠CD16/CD32抗體，阻斷外周巨噬細(xì)胞上的FcγRII/III，顯著延長(zhǎng)PD-1單抗與腫瘤浸潤(rùn)C(jī)D8? T細(xì)胞的結(jié)合時(shí)長(zhǎng)，并且徹-底消除了不響應(yīng)者，聯(lián)合給藥在所有小鼠中實(shí)現(xiàn)腫瘤消除。
圖4 體外共培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)證實(shí)PD-1抗體從T細(xì)胞表面向巨噬細(xì)胞的轉(zhuǎn)移由FcγRII/III介導(dǎo)
圖5 體內(nèi)阻斷FcγR在MC38小鼠模型中延長(zhǎng)PD-1單抗與T細(xì)胞的結(jié)合時(shí)長(zhǎng)，提高治療效果
最后悄悄說(shuō)，抗小鼠CD16/CD32抗體延續(xù)了B家體內(nèi)抗體傳統(tǒng)，相同克隆按實(shí)際抗體含量計(jì)算，性-價(jià)-比超-高，很多機(jī)智的大牛實(shí)驗(yàn)室已經(jīng)用來(lái)發(fā)頂刊啦。如果您想了解這一抗體的更多應(yīng)用案例、使用方法和購(gòu)買信息，歡迎聯(lián)系我們或咨詢我們?cè)谥袊?guó)的一級(jí)授權(quán)代理商欣博盛生物。
參考文獻(xiàn)
1. Nimmerjahn, F, Ravetch, JV (2008) Fcγ receptors as regulators of immune responses. Nat Rev Immunol. 8(1):34-47. doi: 10.1038/nri2206.
2. Galvez-Cancino, F, et al (2024) Fcγ receptors and immunomodulatory antibodies in cancer. Nat Rev Cancer. 24(1):51-71. doi: 10.1038/s41568-023-00637-8.
3. Guilliams, M, et al (2014) The function of Fcγ receptors in dendritic cells and macrophages. Nat Rev Immunol. 14(2):94-108. doi: 10.1038/nri3582.
4. Andersen, MN, et al (2016) Elimination of erroneous results in flow cytometry caused by antibody binding to Fc receptors on human monocytes and macrophages. Cytometry A. 89(11):1001-1009. doi: 10.1002/cyto.a.22995.
5. Unkeless, JC (1979) Characterization of a monoclonal antibody directed against mouse macrophage and lymphocyte Fc receptors. J Exp Med. 150(3):580-596. doi: 10.1084/jem.150.3.580.
6. Arlauckas, SP, et al (2017) In vivo imaging reveals a tumor-associated macrophage-mediated resistance pathway in anti-PD-1 therapy. Sci Transl Med. 9(389):eaal3604. doi: 10.1126/scitranslmed.aal3604.
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