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Alpha-突觸核蛋白操作指南(1)——硫黃素T檢測

更新時(shí)間：2026-02-25   點(diǎn)擊次數(shù)：117次

Alpha-突觸核蛋白操作指南(1).png

硫黃素T檢測


硫黃素T (Thioflavin T) 是一種熒光染料，可以和富含β折疊的結(jié)構(gòu)結(jié)合，例如α-突觸核蛋白原纖維。一旦結(jié)合，硫黃素T的發(fā)射光譜就會(huì)發(fā)生紅移 ，并且熒光強(qiáng)度會(huì)增強(qiáng)，這是一個(gè)很好的用來檢測原纖維形成的測試。

 

以下是用α-突觸核蛋白前體原纖維和單體做的硫黃素T檢測的操作指南。

? 用蒸餾水制備1mM硫黃素T儲(chǔ)備溶液 (新鮮制備并使用0.2μm 注射器過濾器過濾)

? 用PBS pH 7.4稀釋硫黃素T，確保每個(gè)孔中的硫黃素T最終濃度為25μM(每孔溶液體積=100μL). 孔板: Lumox96多孔孔板 (Sarstedt Catalog # 94.6000.024)

? 在將要使用之前才把a(bǔ)lpha突觸核蛋白小份在室溫下解凍

? 在相應(yīng)的孔中加入10μM 前體原纖維或者100μM 單體 (或兩者都有). 用移液器將孔中液體上下吸入排出混合. 濃度為估計(jì)值，需要優(yōu)化來得到好的信號，并避免浪費(fèi)

? 在密封孔板然后置于震蕩孵育器中 (600rpm)，37°C孵育

? 用Molecular Devices Gemini XPS微孔板讀板機(jī)讀取熒光讀數(shù)，使用軟件是Softmax Pro版本為6.5.1

XPS 酶標(biāo)儀設(shè)置參數(shù):

溫度：37°C

讀取形式：孔板掃描

波長：激發(fā)光450nm，發(fā)射光485nm

PMT增益：自動(dòng)

閃光每讀：6

震蕩：讀數(shù)前20秒

 

? 再次密封孔板置于震蕩孵育器下37°C

? 1到72小時(shí)常規(guī)區(qū)間讀數(shù)

 

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